Введение
Несмотря на большое значение гуминовых веществ в природе и биотехнологии сравнительно мало и фрагментарно исследовано их использование и трансформация микроорганизмами.
По мнению одних исследователей, процессы минерализации гуминовых веществ обусловливаются биохимической деятельностью специфической (автохтонной) микрофлоры (Виноградский, 1952; Теппер, 1963). Другие связывают эти процессы с деятельностью всего микробного комплекса почв (Кудрина, 1951; Александрова, 1953). Большинство исследователей изучали разложение гуминовых кислот аэробными бактериями на силикагелевых пластинках, а анаэробных - в жидких средах. Об активности процесса судили по обесцвечиванию питательной среды (Мишустин, Никитин, 1960). В этих опытах было установлено, что наиболее активно процессы разложения гуминовых веществ происходят в условиях кометаболизма, т.е. при наличии в среде помимо гуминовых кислот легкодоступных веществ.
Сравнительно мало изучены процессы использования почвенными бактериями гуминовых кислот в качестве единственного источника углерода и азота. Практически не изучены процессы выделения СО2 и азотфиксации при разложения гуминовых кислот, адсорбированных на поверхности глинистых минералов .
Целью работы было сравнение скорости использования гуминовой кислоты и ряда других органических веществ в качестве единственных источников углерода и азота различными почвенными микроорганизмами.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили следующие субстраты: гуминовая кислота чернозема и из бурого угля, полученная экстракцией щелочью с последующим осаждением в кислой среде, осадок сточных вод после анаэробного сбраживания, целлюлоза, торф верхового болота, компост конского навоза, глюкоза, минеральная среда без источника углерода (контроль).
Культуры бактерий и грибов, используемые в работе, получены из коллекции кафедры биологии почв МГУ им М.В. Ломоносова. Бактерии: 1. Pseudomonas putida, 2. Azotobacter vinelandii, 3. Arthrobacter globiformis; Грибы: 1. Humicola grisea (Traaen), 2. Aspergillus terreus (Thom).
Использовали среду следующего состава (Добровольская и др.,1989) (г/л):
КН2РО4 - 0,9
К2НРО4 - 1,74
МgSО4 - 0,3
СаCl2 - 0,1
NaCl - 0,5
Дрожжевой автолизат - 0,1
Вода дистиллированная - 1,0 литр
В 5 мл среды добавляли субстрат в концентрации 0,5 % и инокулировали 0,5 мл бактериальной суспензии. Все органические субстраты перед добавлением в питательную среду подвергались стерилизации.
О способности бактерий развиваться на средах, содержащих разные природные полимеры в качестве единственного источника углерода и азота, судили по интенсивности образования диоксида углерода и азотфиксирующей активности (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).
Результаты и обсуждение
Изучение интенсивности дыхания Pseudomonas putida и Azotobacter vinelandii в динамике при их развитии на среде с добавлением гуминовой кислоты показало (табл. 1 ), что в течение четырех суток после начала эксперимента происходило выделение СО2 в присутствии гуминовой кислоты после чего интенсивность дыхания бактерий снижалась и уже на 5 сутки не отличалась от контроля. При этом интенсивность темной окраски среды, определяемая присутствием гуминовой кислоты сохранялась неизменной. Повторное введение препарата гуминовой кислоты в среду культивирования сопровождалось краткосрочным ростом интенсивности дыхания исследованных культур бактерий с последующим его снижением до уровня контроля. Такой характер динамики выделения СО2 определяется присутствием в составе исследуемого препарата гуминовой кислоты незначительного количества легкоразлагаемой микроорганизмами фракции органического вещества. Поэтому в дальнейших экспериментах интенсивность дыхания микробных культур оценивали через пять суток после начала эксперимента.
Интенсивность дыхания всех исследуемых штаммов была максимальной при их развитии на среде с глюкозой (табл.2). При росте бактерий Pseudomonas putida и Azotobacter vinelandii с гуминовыми кислотами и целлюлозой скорость эмиссии СО2 достоверно не различалась по сравнению с контролем (среда без источника углерода), что свидетельствует о неспособности исследованных штаммов бактерий к разложению гуминовой кислоты и об отсутствии у изучаемых штаммов бактерий целлюлолитических ферментов. В то же время целюлоза активно разлагалась изученными штаммами грибов(Humicola grisea и Aspergillus terreus), но и грибы также как бактерии не разлагали гуминовые кислоты. Вместе с тем, все исследованные штаммы достаточно активно использовали компост конского навоза и значительно хуже - торф. Наибольшая интенсивность дыхания при развитии на среде с торфом была обнаружена у грибов (Humicola grisea и Aspergillus terreus).
Таким образом, гуминовая кислота оставалась единственным из исследованных природных полимеров, устойчивой к трансформации почвенными бактериями и грибами.
Оценка нитрогеназной активности исследуемых штаммов подтвердила результаты, полученные при изучении интенсивности дыхания (табл. 3). Так, нитрогеназная активность бактерий на среде с гуминовой кислотой и целлюлозой, достоверно не отличалась от активности азотфиксации на среде без источника углерода (контроль). Нитрогеназная активность бактерий на средах с гуминовыми кислотами из разных природных источников (чернозема и бурого угля) не отличались друг от друга, что может свидетельствовать о сходстве их структур.
Таким образом, исследованные штаммы почвенных бактерий были неспособны фиксировать азот на средах, где единственным источником углерода служила гуминовая кислота и целлюлоза. Низкая активность азотфиксации на среде с ОСВ вероятно связана с токсичностью этого продукта для микроорганизмов, на что указывает отсутствие азотофиксирующей активности уже в первые пять суток проведения опыта.
Известно что подщелачивание среды способствует более интенсивному использованию почвенными бактериями гуминовых кислот (Туев, 1989). Нами было проверено сохраняется ли этот эффект в случае когда гуминовые кислоты являются единственным источником углерода и азота. В связи с тем, что измерение интенсивности дыхания по скорости эмиссии СО2 при рН 8.0 представляется затруднительным (диоксид углерода поглощается щелочью). Способность почвенных бактерий использовать гуминовую кислоту в щелочных условиях оценивали по азотфиксирующей активности культур. Как показали результаты наших исследований (табл. 4), подщелачвание приводит к увеличению азотфиксирующей активности бактерий при росте исследуемых штаммов бактерий на среде с гуминовой кислотой.
Большая часть гуминовых кислот в почве адсорбированна на мнеральных поверхностях (Тейт, 1991). Нами была произведена оценка интенсивности дыхания бактерий на среде с кальциевой солью гуминовой кислоты, гуминовой кислотой адсорбированной на монтмориллоните илистой фракции почв (совокупности разных глинистых минералах) и на минеральном остатке из бурого угля. Оказалось, что ни в одном из исследованных вариантов гуминовая кислота, как и в свободном виде, не разлагалась микроорганизмами.
В настоящее время в литературе широко обсуждаются возможные протекторные функции гуминовых кислот в отношении почвенных микроорганизмов. В наших исследованиях штаммы Azotobacter vinelandii и Pseudomonas putida подвергали прогреванию в течение 15 минут при 600oC после чего измеряли интенсивность дыхания. в вариантах с добавлением и без добавления гуминовой кислоты. Как следует из полученных нами данных (табл. 5), сокращение интенсивности дыхания после прогревания в присутствии гуминовой кислоты было практически в два раза ниже, чем у культур не защищенных гуминовой кислотой. Это свидетельствует о том, что гуминовые кислоты могут способствовать почвенным микроорганизмам преодолевать резкие колебания температуры в верхних горизонтах почвы.
Заключение
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что гуминовая кислота является наиболее устойчивым к микробной трансформации природным полимером, что может быть использовано для ее микробиологической идентификации. Показано, что подщелачивание среды способствует использованию гуминовых кислот почвенными микроорганизмами, а ее адсорбция на глинистых минералах или переход в форму гумата кальция не влияют на устойчивость к микробной трансформации.
Однако почвенные микроорганизмы не индеферентны к гуминовым кислотам. Именно с этим связан факт проявления гуминовыми кислотами термопротекторных свойств.
Резюме
Выявлена большая устойчивость гуминовой кислоты по сравнению с другими природными полимерами к разложению почвенными грибами (Humicola grisea, Aspergillus terreus) и бактериями (Pseudomonas putida, Azotobacter vinelandii, Arthrobacter globiformis), что может быть использовано для микробиологической идентификации гуминовой кислоты.
